我們的體外轉(zhuǎn)錄載體是簡(jiǎn)單有效的RNA轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，適用于各種研究。長(zhǎng)RNA體外轉(zhuǎn)錄載體可用于產(chǎn)生RNA探針（即核糖核酸探針），用于原位雜交。

該系統(tǒng)結(jié)合了T7和SP6啟動(dòng)子，您的目的序列將被克隆在這兩個(gè)啟動(dòng)子之間。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件和三磷酸核苷酸的存在下，T7噬菌體RNA聚合酶（T7 RNAP）或SP6 RNAP可以促進(jìn)高效合成核糖核酸探針。這兩個(gè)啟動(dòng)子方向相反，一個(gè)啟動(dòng)子將產(chǎn)生有義轉(zhuǎn)錄物，另一個(gè)將產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)插入片段的方向和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，用?hù)可以選擇使用T7 RNAP、SP6 RNAP或兩者一起進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。T7和SP6啟動(dòng)子側(cè)翼序列也可用作PCR擴(kuò)增或測(cè)序的引物結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)利用半抗原標(biāo)記的或熒光基團(tuán)標(biāo)記的或是放射性標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，以便于原位雜交探針定位檢測(cè)。我們建議您參考已發(fā)表文獻(xiàn)中經(jīng)測(cè)試的體外轉(zhuǎn)錄和原位雜交步驟說(shuō)明來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

T7和SP6 RNAP對(duì)于有效的轉(zhuǎn)錄起始均具有堿基要求，且這些堿基已經(jīng)被放置到載體上。T7啟動(dòng)子3'末端的前兩個(gè)堿基是GG，緊接著是客戶(hù)的目的序列；SP6啟動(dòng)子3'末端的前三個(gè)堿基是GAA，緊接著是客戶(hù)的目的序列。

我們的長(zhǎng)RNA體外轉(zhuǎn)錄載體會(huì)發(fā)生失控轉(zhuǎn)錄，這意味著T7和SP6 RNAP的轉(zhuǎn)錄能進(jìn)行到DNA模板的末端，不會(huì)在質(zhì)粒內(nèi)的任何特定位點(diǎn)終止。因此，在體外轉(zhuǎn)錄之前，應(yīng)單酶切線(xiàn)性化環(huán)狀質(zhì)粒。在T7啟動(dòng)子上游含有BsiWI、AgeI和AscI單酶切位點(diǎn)；在SP6啟動(dòng)子的上游含有AvrII，XhoI，NotI和SapI單酶切位點(diǎn)，這些酶切位點(diǎn)均可以在目的序列的下游進(jìn)行單酶切。值得注意的是，待轉(zhuǎn)錄的序列不能含有所用線(xiàn)性化酶切位點(diǎn)，以免產(chǎn)生截短的mRNA。不純的酶切產(chǎn)物可能會(huì)抑制隨后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此建議通過(guò)柱子或酚氯仿來(lái)純化酶切產(chǎn)物。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的長(zhǎng)RNA體外轉(zhuǎn)錄載體能高效用于T7或SP6 RNAP介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄。該載體在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，易于酶切，有助于大量生成mRNA。

效率高：T7和SP6  RNAP是高效酶，其介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄可大量產(chǎn)生功能性RNA。

技術(shù)簡(jiǎn)單：與其他探針合成方法相比，使用質(zhì)粒模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，操作更方便。

雙向性：該載體系統(tǒng)含有兩個(gè)體外轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，以相反方向分別在目的序列的兩側(cè)。 客戶(hù)可以根據(jù)目的序列的方向，選擇T7或SP6啟動(dòng)子來(lái)合成有義或反義核糖核酸探針。

失控轉(zhuǎn)錄：為了產(chǎn)生正確有效的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前需要通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化質(zhì)粒模板。

T7 promoter: A promoter for the RNA polymerase from T7 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest. This promoter is in the opposite orientation to the SP6 promoter, and will generate a transcript which is the reverse-complement of that produced from the SP6 promoter using the same template.

Transcribed sequence: Your DNA sequence of interest to be transcribed into RNA is placed here.

SP6 promoter: A promoter for the RNA polymerase from SP6 bacteriophage. Drives high-level transcription of the downstream sequence of interest. This promoter is in the opposite orientation to the T7 promoter, and will generate a transcript which is the reverse-complement of that produced from the T7 promoter using the same template.

BsiWI, AgeI, AscI, AvrII, XhoI, NotI, SapI: Unique restriction endonuclease sites that can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.